آزمون تب زایی (پیروژنیک، اندوتوکسین و مونوسیت)

روش آزمون:

آزمون تب زایی و اندوتوکسین مطابق با استاندارد بین المللی ISO 10993-11 و  USP 85-151انجام می شود. این آزمون به دو روش ذیل انجام می شود:

1. آزمون درون­ تنی (in-vivo) با تزریق نمونه به بدن خرگوش انجام می­ شود که کامل­ترین تست تب ­زایی بوده و برای همه محصولات پزشکی کاربرد دارد (تمامی عوامل تب ­زا). در این روش پس از تزریق عصاره نمونه به خرگوش، دمای بدن به صورت متوالی اندازه­ گیری و تغییرات در دمای بدن حیوان گزارش می­ شود.
2. آزمون برون­ تنی (in vitro) با استفاده از کیت(LAL  (Limulus Amebocyte Lysate انجام می­ شود که فقط برای یک سری از محصولات پزشکی کاربرد داشته (فقط اندوتوکسین ها) و روش سریع و صنعتی می­ باشد. در این روش عصاره سلول خونی Amebocyte خرچنگ نعل اسبی به عنوان مکانیسم دفاعی در برابر اندوتوکسین نمونه بسیار حساس است و با شناسایی آن پس از زمان مشخصی واکنش نشان می دهد

مقدمه آزمون های تب زایی:

به طور کلی به موادی که پس از ورود به بدن، منجر به افزایش غیر طبیعی دمای بدن می شوند، مواد تب زا گفته می شود. از آن جایی که اغلب تجهیزات پزشکی و دارویی باید فاقد خاصیت تب زایی باشند، انجام آزمون تب زایی برای آن ها الزامی است. بدین منظور آزمون های مختلفی برای بررسی تب زایی طراحی شده است که مهم ترین آن ها در شکل ذیل نمایش داده شده است.

تفاوت آزمون تب برون تنی (اندوتوکسین باکتریایی یا LAL) با تب درون تنی (بر خرگوش) چیست؟

قبل از پاسخ  به این پرسش، باید بدانیم که موادی که باعث پاسخ تب در بدن می شوند در دو گروه عمده جای دارند:

• اگزوژن های تب زا (منشا خارجی): پاسخ تب عمدتا ناشی از باکتری های گرم منفی (دیواره سلولی برخی گرم منفی ها –اندوتوکسین یا لیپوپلی ساکارید LPS)، باکتری های گرم مثبت و یا قارچ ها است.
• اندوژن های تب زا (منشا داخلی): پاسخ تب عمدتا ناشی از اینترلوکین های سیستم ایمنی، سیتوکین IL1، IL2، TNF و اینترفرون ها است.

از آن جایی که اغلب واکنش تب، ناشی از حضور اندوتوکسین های باکتری های گرم منفی رخ می دهد، آزمون تب برون تنی LAL، بسیار رایج است. اما توجه داشته باشید که عوامل تب زای دیگری مانند اجزای باکتری های گرم مثبت، اسید لیپوتئیک LTA، زایموزان قارچی، اینترلوکین­ها و مواد شیمیایی تب زا نشت یافته از نمونه (material mediated pyrogens MMPs) هم باعث ایجاد واکنش تب می شوند. در نتیجه آزمون تب زایی در بدن خرگوش، آزمون بسیار کامل تری از نظر شناسایی عوامل تب زا محسوب می شود. به عبارت دیگر، در آزمون اندوتوکسین باکتریایی صرفا اندوتوکسین ناشی از باکتری های گرم منفی بررسی می شود و عوامل تب زا دیگر ناندیده گرفته می شوند. در حالی که آزمون تب زایی بر خرگوش می تواند هر نوع عامل تب زا را شناسایی کند.

به چه دلیل از خرگوش آزمایشگاهی برای این آزمون استفاده می شود؟

با وجود تلاش های زیادی که برای حذف استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انجام شده است، اما استفاده از حیوانات آزمایشگاهی در صنعت داروسازی و تجهیزات پزشکی، غیر قابل جایگزین است. هر چند در صنعت مواد آرایشی و بهداشتی، استفاده از حیوانات آزمایشگاهی به حداقل رسیده است. خرگوش های آزمایشگاهی به دلایل ذیل برای این آزمون مورد استفاده قرار می گیرند:

• دمای بدن قابل پیش بینی دارند
• پاسخ قابل تکرار و یکسان مرتبط با تغییرات دمای بدن بروز می دهند
• پاسخ بدن خرگوش به تغییرات دمایی مشابه انسان است
• به همه انواع مواد تب زا واکنش نشان می دهند

سال ها قبل اعضا ISO/TC WG7 با وجود منفی بودن آزمون تب زایی اندوتوکسین باکتریایی (LAL)، عوامل تب زا را در خرگوش مشاهده کردند. لذا استفاده از آزمون تب زایی بر خرگوش در استاندارد های مختلف بیان شده است. به منظور کاهش استفاده از حیوانات آزمایشگاهی، اعضای WG7 وسایل پزشکی که فاقد مواد شناخته شده تب زا هستند را نیازمند آزمون تب حیوانی به شمار نیاوردند. اما اعضای FDA این مورد را در نفی کردند زیرا استفاده از مواد پلیمری جدید در تجهیزات پزشکی ممکن است منجر به ایجاد واکنش تب گردد. عمدتا تجهیزاتی که درجه خطر بالاتری دارند و یا حاوی مواد شیمیایی جدید هستند باید از لحاظ ایجاد تب بررسی گردند. از جمله موادی که منجر به واکنش تب زایی درون تنی می گردند می توان به موارد ذیل اشاره کرد:

• تب زاهای اندوژن (مانند IL-1، IL-6، TNFα، INF-γ)
• پروستاگلاندین
• Inducers (مانند پلی آدنیلات، پلی اوریدیلیک، پلی بیونوسینیک و اسید پلی ریبوسیتیدیلیک)
• مواد مختل کننده عملکرد مرکز تنظیم دما (مانند LSD، کوکائین، مورفین)
• عوامل غیر باند شده اکسیداتیو فسفوریلاسیون (مانند 4,6-dinitro-o-cresol، دی نیتروفنل، اسید پیکریک)
• N-phenyl-β-naphthylamine و aldo-α-naphthylamine (مکانیسم تب زایی ناشناخته ای دارند)
• اندوتوکسین باکتریایی (مانند TSST-1، SEA، Spe F، Spe C)
• نوروترانسمیتر ها (مانند نورآدرنالین، سروتونین)
• موادی مانند نمک های نیکل و سایر موارد

همه مواد لیست شده به جز عوامل غیر باند شده و نفاتیل آمین ها، در دسته مواد تولید کننده تب شناخته می شوند و حتی در صورتی که با افزودنی های شیمیایی دیگر همراه باشند، به طور مستقیم باعث اختلال در مرکز تنظیم دما هیپوتالاموس مغز می شوند.

این مواد عمدتا به عنوان مواد مصرفی در تجهیزات پزشکی استفاده نمی شوند. نفاتیل آمین ها به عنوان رابر (مثلا در کاتتر ازوفاگال) به عنوان عوامل ضد پیری استفاده می شوند، اما این ماده اخیرا به علت پتانسیل سرطانزایی دیگر استفاده نمی شود. سیتوکین ها در محصولات پزشکی حاوی سلول های زنده، وجود دارند که در دسته تجهیزات پزشکی قرار نمی گیرند.